基于ldquo肠道菌群炎症rdq

摘要：目的观察丹蒌片对高脂喂养动脉粥样硬化模型ApoE?/?小鼠的影响，从菌群失调诱发炎症角度探讨丹蒌片抗动脉粥样硬化的作用机制。方法采用C57BL/6J野生型小鼠作为对照，高脂喂养ApoE?/?小鼠24周后随机分为模型组、丹蒌片组，连续ig给药8周后取血测定血脂水平；ELISA法检测血清中脂多糖（LPS）水平；动脉大体油红O及主动脉窦HE染色观察斑块形成；粪便16SrRNA扩增子测序检测肠道菌群；GC-MS法检测短链脂肪酸；实时荧光定量PCR法检测炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和白细胞介素-1β（IL-1β）mRNA的表达。结果与对照组比较，模型组小鼠血脂水平升高，肠道菌群失调，有害菌增加，有益菌减少，血清LPS水平升高，主动脉周围炎症水平升高；与模型组比较，丹蒌片干预可明显降低小鼠总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平（P＜0.01），有效减少斑块面积；调节肠道菌群，进而降低血清LPS及主动脉周围炎症因子TNF-α、ICAM-1和IL-1β水平（P＜0.01）。结论丹蒌片通过改善菌群结构，降低菌群失调诱发的炎症反应发挥抗动脉粥样硬化作用。

伴随我国经济的日益发展、生活水平的逐渐提高，人均寿命延长，年龄相关性心脑血管疾病的危害日趋严重。联合国卫生组织调查证实动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）所致的心脑血管疾病是当今威胁人类健康的主要疾病[1]。AS由多种因素共同作用所引起，发病机制复杂，但目前对其病因及机制研究进展较缓慢。近期研究表明，肠道菌群与人体血管健康密切相关，其中肠道菌群组成的变化可以通过激活Toll样受体（TLRs）信号转导通路[2]，引发机体天然免疫反应，导致炎症发生，而炎症反应在AS的发生发展中起重要作用。目前，肠道菌群与心血管疾病之间的关系已经逐渐被人们所熟知，肠道菌群失调导致动脉粥样硬化的相关分子机制研究得到进一步加深。AS归属于中医学“胸痹”“心痛”及“真心痛”等疾病范畴。系统回顾和荟萃分析[3-4]表明，中医药可能为心血管疾病患者提供另一种治疗选择，具有良好的临床应用前景[5]。研究证实中医药在防治AS方面可发挥良好的抗炎作用，但其具体机制及靶点尚未完全阐释清楚。丹蒌片以《金匮要略·胸痹心痛短气病脉证治》中的“瓜蒌薤白白酒汤”为基础方，以瓜蒌皮及薤白为君药，并加入川芎、丹参和赤芍等活血化瘀之品而成，可用于痰瘀互结所致胸痹心痛[6-9]。目前已有不同的研究采用液相色谱-质谱联用或气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术检测丹蒌片的主要化学成分，初步确定了非挥发性成分中的68种化合物，并从挥发性成分中鉴定出44个化合物[10-11]。此外现代药理研究显示丹蒌片可以通过调脂、抗炎及稳定斑块改善患者临床症状[12]，在防治AS方面具有良好的效果。实验室前期研究[13]同样证实了丹蒌片通过有效抗炎、调脂作用改善了ApoE?/?小鼠AS病变，因此本研究在前期研究的基础上进一步通过观察丹蒌片干预高脂喂养ApoE?/?小鼠斑块形成情况、血清脂多糖（LPS）水平、斑块周围炎症因子水平及肠道菌群的改变，评价丹蒌片防治AS的相关机制，从而拓展丹蒌片的作用靶点。

1材料

1.1实验动物

选用5周龄SPF级雄性ApoE?/?小鼠（品系C57BL/6J）作为模型动物，选用同周龄雄性C57BL/6J野生型小鼠作为对照[14]，体质量（20±4）g，实验动物购自维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）-。

1.2饲料

乳脂动脉粥样硬化饲料（含21%脂肪和0.15%胆固醇），批号MD，购自江苏美迪森生物医药有限公司。

1.3药品、试剂与仪器

丹蒌片购自吉林康奈尔药业有限公司（批号）；MC紫外可见分光光度计（上海光学仪器一厂）；荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；三酰甘油（TG）、血清总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）及油红O试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；LPS检测试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司；qRT-PCR试剂盒购自北京天根生化科技公司，引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其余均为市售分析纯。

2方法

2.1模型制备、分组与给药

适应性饲养1周后，C57BL/6J野生型小鼠饲以普通饲料，作为对照组。ApoE?/?小鼠饲以高脂饲料24周以复制AS模型。24周后，将ApoE?/?小鼠随机分为模型组和丹蒌片组，每组各15只，根据体表面积折算法，计算出小鼠给予丹蒌片水溶物的人鼠等效剂量为0.55g/kg，对照组和模型组小鼠ig给予等体积的生理盐水，每日给药1次，共给药8周。本研究动物实验得到天津中医药大学动物管理委员会（批准号TCM-LAEC）批准实施。

2.2血清学指标检测

干预结束后，小鼠内眦取血，静置30min，于4℃、r/min离心15min，收集血清，?80℃冻存备用。采用血脂试剂盒检测TC、TG、LDL-C和HDL-C水平；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测LPS水平，具体步骤参照检测说明书进行。

2.3全主动脉斑块观察

剪开小鼠右心耳，快速以预冷生理盐水从左心室进行灌流，至右心房流出澄清液体为止。分离、切取主动脉全长，体视镜下仔细剥离外膜，剖开、展平、福尔马林固定24h，60%异丙醇润洗10min，油红O染液浸染10min，70%乙醇分化、水洗，直至斑块呈鲜红色，其余部分呈白色为止。取出动脉，置于载玻片上，铺平、拍照后，用Image-ProPlus6.0数据分析软件分析红染部分（斑块）面积占全动脉面积的百分比。

2.4主动脉根部斑块及肝脏病理学观察

分离小鼠心脏及肝脏，心脏全部及肝大叶用福尔马林固定，行常规石蜡连续切片，HE染色。心脏每5张连续切片留取1张用于观察统计。通过LeicaQwinImageProcessingandAnalysis软件分析切片，测量AS斑块横截面积，并计算校正斑块面积（校正斑块面积＝斑块面积/血管管腔面积）。

2.5肠道菌群及短链脂肪酸检测

实验干预结束后，取材之前，收集小鼠新鲜大便，?80℃冰箱保存，用于肠道菌群及短链脂肪酸的检测。其中肠道菌群检测采用16SrRNA扩增子测序法，CTAB法提取样本DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度及浓度后，稀释样品至1ng/μL，行PCR扩增，引物对应区域16SV4区（F和R）；PCR产物混样和纯化之后进行文库构建和上机测序。

短链脂肪酸含量测定采用GC-MS法。将新鲜小鼠粪便溶于含μL甲醇溶液的EP管中，制成粪便悬液，并用硫酸调节pH值在2～3，静置，混匀之后0r/min离心20min，取上清用于GC-MS分析。检测条件：用氮气为载体，控制气体积流量为1mL/min，色谱柱起始温度设置为℃，时间0.5min，接着以8℃/min升温至℃，时间维持1min，然后以20℃/min升温至℃，时间维持5min，检测器的温度设置为℃，进样口温度为℃，进样体积1μL，每个样本的检测时间为20.9min。

2.6实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测炎症因子mRNA的表达

采用Trizol提取主动脉总RNA，测定RNA浓度及纯度。以总RNA为模板，按照RT试剂盒步骤反转录成cDNA；以cDNA为模板进行PCR扩增，以GAPDH为内参，目的基因TLR4、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和白细胞介素-1β（IL-1β）引物序列见表1。扩增条件：95℃预变性15min，95℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸1min，循环40次。采用2?ΔΔCt法计算样品中目的基因相对表达量。

2.7统计学处理

采用SPSS18.0统计软件包进行数据分析。计量资料以表示。正态分布数据采用单因素方差分析，组间差异比较采用LSD-t法，检验水准（α）为0.05。

3结果

3.1丹蒌片对ApoE?/?小鼠血脂水平的影响

与对照组比较，模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均显著升高（P＜0.01），HDL-C有升高趋势，但差异不显著。与模型组比较，丹蒌片能够有效降低小鼠血清TC、TG、LDL-C水平（P＜0.01），升高血清HDL-C水平，但差异不显著，见表2。

3.2丹蒌片对ApoE?/?小鼠血清LPS水平的影响

与对照组比较，模型组小鼠血清LPS显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，丹蒌片干预8周后，小鼠血清LPS水平存在下降趋势，但差异不显著，见表3。

3.3丹蒌片对ApoE?/?小鼠肝脏病变的影响

对照组小鼠低倍镜下可见肝小叶结构完整，中央静脉清晰可见，高倍镜下显示肝细胞形态规则呈多边形、界限清楚，核大而圆，位于胞质中间。模型组小鼠肝小叶结构紊乱，中央静脉挤压变形，肝索排列紊乱，肝细胞脂肪变性明显，体积变大，脂滴明显可见（HE染色可见小空泡）。丹蒌片干预后，小鼠肝小叶结构紊乱得到改善，肝细胞脂肪变性较模型组明显减轻，脂滴明显减少（图1）。

3.4丹蒌片对ApoE?/?小鼠主动脉内膜斑块面积的影响

主动脉大体油红O染色结果（图2和表4）显示，对照组小鼠主动脉内膜无红染，未见斑块形成。模型组小鼠主动脉内膜可见散在、面积较大的红染斑块。丹蒌片组小鼠主动脉红染区域明显减少（P＜0.01）。

3.5丹蒌片对ApoE?/?小鼠主动脉根部斑块形成的影响

主动脉根部HE染色结果（表5和图3）显示，对照组小鼠主动脉根部内膜光滑完整，无斑块形成。模型组小鼠主动脉根部可见明显的斑块形成，内膜增厚，纤维帽及胆固醇结晶并存，伴有炎细胞浸润，绝大多数斑块内存在钙盐沉积。丹蒌片干预后，斑块面积及斑块校正面积较模型组明显减少（P＜0.01）。

3.6丹蒌片对ApoE?/?小鼠主动脉炎症因子的影响

与对照组比较，模型组小鼠主动脉炎症相关因子TLR4、TNF-α、IL-1β、ICAM-1mRNA水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，丹蒌片干预8周后，小鼠主动脉TLR4mRNA水平有下降趋势，但差异不显著，TNF-α、ICAM-1、IL-1βmRNA水平均显著降低（P＜0.01，表6）。

3.7丹蒌片对ApoE?/?小鼠肠道短链脂肪酸的影响

与对照组比较，模型组小鼠肠道中短链脂肪酸乙酸、丙酸及丁酸水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，丹蒌片干预后，仅丁酸水平有升高趋势，而乙酸及丙酸水平反而有下降趋势，但差异不显著（表7），说明丹蒌片有效抗动脉粥样硬化并非通过短链脂肪酸途径起作用。

3.8丹蒌片对ApoE?/?小鼠肠道菌群的影响

3.8.1微生物菌落物种丰富度在门水平上（图4和表8），与对照组比较，模型组小鼠肠道内的有益菌拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度下降，且拟杆菌门/厚壁菌门（Firmicutes）值减小（P＜0.05），有害菌厚壁菌门相对丰度有增加趋势，但差异不显著。与模型组比较，丹蒌片干预8周后，有益菌拟杆菌门水平明显升高（P＜0.01），厚壁菌门有下降趋势，但差异不显著，而拟杆菌门/厚壁菌门值升高（P＜0.05）。

3.8.2肠道菌群物种α多样性分析与对照组比较，模型组小鼠肠道菌群丰度指数Ace及Chao1升高（P＜0.05，表9），菌群多样性指数Shannon及Simpsonindex有升高趋势，但差异不显著。与模型组比较，丹蒌片干预8周后，小鼠肠道内菌群丰度指数明显降低（P＜0.01），而菌群多样性指数变化不明显。

3.8.3Beta多样性分析各组样本的主成分分析（PCA）结果显示，对照组、模型组及丹蒌片组在第1主成分（23.24%）及第2主成分（10.61%）可显著分离，说明各组菌群组成存在一定的差异（图5）。

3.8.4微生物组间差异分析采用线性判别分析对每组样本肠道菌群的效应大小进行分析，在门水平上（图6、7），对照组小鼠肠道菌群以拟杆菌门为主，模型组以变形菌门Proteobacteria及疣微菌门Verru

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