Science肠道菌产生的肌苷调节对检查

这篇文章的通讯是加拿大卡尔加里大学卡明医学院的教授。她们实验室侧重于研究在动态相互作用的肠道微生物群和在稳态和炎症状态下的先天和适应性免疫，主要通过使用无菌和悉生小鼠模型，了解在生命早期接触肠道微生物如何调节发育中的免疫系统和这如何影响免疫介导疾病的易感性，如过敏和自身免疫疾病。肠道微生物组的研究需要在动物模型中分离单个细菌，以排除其他环境因素。

这是他们最近发表的文章，第一篇讲了微生物产生的乳酸，作为血管内免疫屏障的调制器，保护通过血液的细菌感染的传播。另一篇20年的science是关于B细胞库如何因粘膜或系统性淋巴组织微生物群暴露而形成，以及不同暴露位点之间的相互作用或随后对不同类群的暴露如何影响B细胞形成。19年的science主要是使用小鼠自发性自身免疫性心肌炎模型，表明，心肌炎进展为致命性心脏病依赖于心肌肌球蛋白特异性TH17细胞，它能被肠道的共生拟杆菌模拟肽调节…通过操纵微生物组能抑制心脏毒性T细胞的能力，从而将炎症性心肌病转化为可靶向性疾病。

背景

免疫检查点阻断，即ICB是一种癌症疗法，通过阻断免疫细胞表达的抑制受体，或者免疫检查点，激活内源性抗肿瘤T细胞，从而开启机体天然屏障，杀死癌细胞。在免疫疗法中，免疫系统会破坏恶性肿瘤。一类治疗方法可靶定CTLA-4，它是在杀伤T细胞表面表达的一个分子，能阻断杀伤T细胞的增殖。阻断CTLA-4的抗体药物，能激发杀伤T细胞反应，从而可以靶定癌细胞，并明显延长许多黑色素瘤患者的生存期。其中一个例子就是CTLA-4的阻断剂-伊匹单抗能够延长转移性黑色素瘤患者的生存期。

PD-1是免疫检查点，通过两种机制防止自身免疫。它既可以促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡（程序性细胞死亡）。也可以减少调节性T细胞（抗炎，抑制性T细胞）的细胞凋亡。许多肿瘤细胞表达PD-L1，一种免疫抑制的PD-1的配体;抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用可以增强体外T细胞反应并介导临床前抗肿瘤活性。

例如这篇文章表明在包括非小细胞肺癌、黑色素瘤和肾细胞癌在内的晚期癌症患者中，抗体介导的PD-L1阻断可导致持久的肿瘤消退和长期的疾病稳定。

有效抗肿瘤免疫应答的诱导成功需要以下几点（i）抗原呈递和T细胞活化，（ii）T细胞运输和肿瘤浸润，以及（iii）肿瘤微环境内的T细胞杀伤活性。在这些阶段的每一个阶段存在的各种免疫逃逸机制可能导致对免疫疗法的原发性或获得性抗性。

虽然ICB是一种常见的癌症疗法，然而，许多其他癌症对ICB治疗表现出原发性耐药，即使在已经证明ICB治疗有效的癌症，如转移性黑色素瘤中，它的应答率仍然很低，且患者之间存在差异。右边这个图就表示的是转移性黑色素瘤进行了抗CTLA-4和抗PD-1联合免疫治疗后的原发性耐药。

因此，迫切需要确定这种无应答的潜在机制。最近许多研究表明，肠道菌群可以影响抗肿瘤免疫，肠道菌群的组成甚至可以预测ICB的疗效，ICB疗法的疗效依赖于特定的肠道细菌，用促进ICB的细菌治疗可能有助于克服对ICB治疗的主要耐药性。比如这篇15年的science就报道了：靶向CTLA-4抗体的抗肿瘤作用依赖于不同种类的拟杆菌。在小鼠和患者中，T细胞对多形拟杆菌或脆弱拟杆菌的特异性反应与CTLA-4阻断的疗效相关。抗生素处理或无菌小鼠的肿瘤对CTLA阻断没有反应。通过灌菌、脆弱拟杆菌多糖免疫或菌特异性T细胞的移植均可克服这一无应答。将人类粪便微生物移植到小鼠身上证实，用CTLA-4抗体治疗黑色素瘤患者有利于具有抗癌特性的脆弱拟杆菌的生长。该研究揭示了拟杆菌在CTLA-4阻断免疫刺激作用中的关键作用。

另一篇也是15年的science,比较了具有不同共生菌群的小鼠的黑色素瘤生长情况，并观察到了自发抗肿瘤免疫的差异，这些抗肿瘤免疫的不同在合笼后或粪便转移后被消除。16SRNA测序发现双歧杆菌与抗肿瘤作用相关。单独双歧杆菌灌胃可与PD-L1特异性抗体治疗在相同程度上改善肿瘤，联合治疗几乎消除了肿瘤的生长。树突状细胞功能增强导致CD8+T细胞在肿瘤微环境中的激活和积累增加。这篇文章表明，操纵微生物群可能调节癌症免疫治疗。

18年的science报道了对ICB治疗的主要抗性可归因于肠道菌群组成的异常。在晚期癌症患者中，抗生素抑制了ICB的临床疗效。对ICB治疗有反应的癌症患者的粪便菌群移植进入无菌或抗生素治疗的小鼠体内，可以改善PD-1阻断的抗肿瘤效果，而对治疗无反应的患者粪便菌群移植则不能。诊断时患者粪便样本的宏基因组学显示了对ICB治疗的临床反应和AKK菌的相对丰度之间的相关性。将无应答患者的粪便菌群移植给小鼠后后给小鼠AKK菌灌胃，通过增加CCR9+CXCR3+CD4+T淋巴细胞进入小鼠肿瘤组织，并依赖于白细胞介素-12，恢复了对PD-1阻断的抗肿瘤作用。

尽管研究发现特定的细菌种类与增强抗肿瘤免疫有关，但这些微生物增强ICB治疗的确切分子机制仍不清楚。本文使用了结直肠癌(CRC)动物模型来识别特异性的ICB促进细菌，阐明这些微生物如何增强ICB治疗效果的潜在分子机制，并在膀胱癌和黑素瘤的其他模型中验证了该发现。

接下来介绍一些结直肠癌与菌群及免疫检查点阻断疗法相关的背景知识。

首先是肠道菌群可以影响CRC的进展，18年的science报道家族性腺瘤性息肉病患者的结肠粘膜富集能产生大肠杆菌素的大肠杆菌及能产生BFT的脆弱拟杆菌，给结肠炎易化小鼠定植大肠杆菌或脆弱拟杆菌能使结肠IL17增加，及结肠上皮DNA损伤，从而加快肿瘤进展并提高死亡率。

还有报道肠道菌群可能改变CRC化疗的疗效，13年的science报道了环磷酰胺改变了小肠中菌群的组成，并诱导了特定的革兰氏阳性菌向次级淋巴器官的易位。这些细菌在次级淋巴结刺激“致病性”pTH17细胞和记忆TH1免疫应答的产生。无菌的或经抗生素治疗的荷瘤小鼠显示pTH17反应降低，并且它们的肿瘤对环磷酰胺具有抗性。pTH17细胞的移植部分恢复了环磷酰胺的抗肿瘤功效。这些结果表明，肠道菌群有助于塑造抗癌免疫反应。

但在临床上，ICB疗法在大多数CRC病例中是无效的，而肠道菌群在无响应组的作用仍然未知。

摘要

一些肠道细菌已被证实与检查点阻断免疫疗法，简称为ICB的疗效增强有关，但其增强抗肿瘤免疫的潜在机制尚不清楚。在本研究中，分离出了假长双歧杆菌、约氏乳酸杆菌和欧陆森氏菌三种细菌，它们在四种癌症小鼠模型中显著增强了免疫检查点抑制剂的功效。假长双歧杆菌通过代谢产物肌苷的产生调节增强免疫治疗反应。免疫治疗引起的肠道屏障功能下降，增加了肌苷的全身易位和活化的抗肿瘤T细胞。肌苷的作用依赖于腺苷A2A受体的T细胞表达，需要共刺激。本研究确定了一个新的由免疫治疗激活的微生物代谢产物免疫途径，它可能被开发为基于微生物的辅助治疗。

结果

用氮氧甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸盐钠(DSS)诱导结肠肿瘤，用抗CTLA-4或抗LD-L1抗体能够显著减少并且减小肿瘤，并且减少肿瘤内的EpCam+Lgr5+细胞，该细胞是上皮细胞干细胞特性的marker，抗CTLA-4抗体也会导致免疫细胞到肿瘤的浸润增加。

并且在肿瘤引流淋巴结能观察到CD8+T细胞以及在脾脏中IFN-γ+CD4+T及CD8+T的比例升高，表明抗肿瘤免疫的激活。接下来，使用这个模型来筛选与ICB反应相关的潜在有益细菌。在ICB处理组和对照组没有观察到粪便的整体菌群组成，即β多样性的显著差异D，一些科水平的菌的丰度有差异E；相反，肿瘤组织内的菌群在不同组之间β多样性有差异。

在ICB处理的肿瘤内观察到一些菌属富集。对两组均质瘤进行厌氧培养，培养并鉴定出了21种不同的菌G，其中有七种菌仅存在于ICB处理的肿瘤组织，四种菌仅存在于对照组。假长双歧杆菌即为一种仅存在于ICB处理的肿瘤的菌，它属于双歧杆菌属，之前已经用测序的方法检测到了它在ICB肿瘤中的富集，AKK菌之前已经被证实能增强抗PD-L1/PD-1在肺癌和肾癌中的作用，它也是只在ICB处理肿瘤中存在的一种菌。

由于在原位腺癌模型中菌群有限，作者于是将模型切换为CRC异位移植模型，利用MC38细胞移植到无菌小鼠或者SPF级小鼠体内构建模型，待能触摸到肿瘤，进行ICB治疗。与GF小鼠相比，SPF小鼠肿瘤变小，且瘤内及脾内CD4+及CD8+T细胞的激活与增殖均增加，确定了ICB治疗对CRC的作用依赖于菌群。

在广谱抗生素处理后的小鼠中也观察到了与无菌小鼠同样的结果，因此证明了ICB治疗对CRC的作用是依赖于菌群。

为了研究在ICB治疗组的肿瘤中富集的菌对ICB治疗效果的影响，GF小鼠单定植五种分离出的仅在ICB组存在的不同的菌，将M38肿瘤细胞注射给小鼠，当肿瘤可感知时，给小鼠抗CTLA-4抗体，然后检测肿瘤生长和抗肿瘤免疫相关的指标。单定植假长双歧杆菌、约氏乳酸杆菌和欧陆森氏菌能显著增强抗CTLA-4的抗肿瘤效果，并且增加激活的CD4+和CD8+T细胞。

抗肿瘤免疫反应是依赖于ICB治疗的，因为只定植假长双歧杆菌而不给抗CTLA-4治疗无法减少肿瘤生长并诱发抗肿瘤免疫反应。

虽然假长双歧杆菌不能单独诱导抗肿瘤免疫，但它能诱导小肠固有层中CD4+T细胞的T-bet表达显著升高B，T-bet是TH1细胞的主要转录调节因子，表明其在没有ICB的情况下有免疫调节效应，但是该效应在脾中并不存在C。但是该免疫调节效应并没有激活TH1的效应功能，因为IFN-γ+T-bet+细胞并没有增加。因此，在没有肿瘤和ICB存在的情况下，假长双歧杆菌能够在肠相关的淋巴组织内促进TH1转录分化，但是并不增加肠TH1细胞的效应功能。

已经知道了单独的肠道假长双歧杆菌的定植能够在肠粘膜局部诱导TH1的分化，接下来想研究在没有肿瘤的情况下，假长双歧杆菌的定植与抗CTLA-4共同作用能否诱导全身的TH1激活。发现假长双歧杆菌和ICB治疗共同作用，能显著升高脾TH1的激活以及效应功能。因此。得出结论，B.pseudolongum诱导TH1分化，并与抗CTLA-4一起激活TH1效应T细胞。接下来就想研究抗CTLA-4的使用如何导致对TH1效应的不同。已知肠炎是ICB治疗的一个常见的副作用，因此认为这种不同可能是由于肠屏障完整性的改变。事实上，菌定植与ICB共同作用的小鼠血清抗菌抗体反应显著增加，尤其是TH1相关的免疫球蛋白IgG2b，并且小肠跨上皮电阻降低，表明ICB治疗后上皮完整性确实被破坏。ICB治疗并没有引起明显的局部或全身性炎症。

接下来验证了抗菌抗体的增加是否是假长双歧杆菌促进ICB作用的机制。用无法产生抗体的基因缺陷小鼠进行实验，发现抗体的缺陷并不影响假长双歧杆菌对ICB的抗肿瘤效果的促进作用。因此得出ICB的促进作用不需要全身性抗菌抗体的参与。现在已经得出：ICB治疗会影响肠屏障的完整性，并且B细胞及抗菌抗体不参与该菌的ICB促进作用，因此就假设：菌产生的代谢物的易位导致了假长双歧杆菌在ICB治疗时的全身效应。

为了验证是菌产生的代谢物气的作用，从GF、假长双歧杆菌或大肠葡聚糖杆菌定植，用抗CTLA-4处理的肿瘤小鼠中收集血清，将其输给抗CTLA-4处理的GFMC38肿瘤小鼠，假长双歧杆菌定植的小鼠的血清能够减少肿瘤生长，并引起强烈的抗肿瘤免疫反应。这些结果表明：假长双歧杆菌产生的，或者由其诱导的可溶性因子引起了促进ICB的抗肿瘤效应。

对血清样本的非靶向代谢组学分析显示：假长双歧杆菌组的血清中有几种代谢物水平升高，其中，嘌呤代谢物肌苷显著升高（八到九倍）。菌培养的上清分析表明假长双歧杆菌和AKK菌都能产生高水平的肌苷，表明肌苷是这两种菌产生的代谢物。而另一种有ICB促进作用的欧陆森氏菌能产生大量的次黄嘌呤，它与肌苷能激活相同的受体。

接下来检测了假长双歧杆菌单定植小鼠十二指肠，空肠和盲肠的肌苷的浓度，发现肌苷在十二指肠浓度最高，之后依次降低，也检测了SPF小鼠在ICB治疗后，再给与抗生素处理这一变化过程中血清中肌苷的浓度，这些结果表明：细菌在上消化道产生的肌苷可能是假长双歧杆菌单定植小鼠全身肌苷水平升高的主要来源。

接下来为了检测肌苷能否在体外增加TH1分化，将骨髓来源的DC细胞与幼稚CD4+T细胞共培养，并且添加肌苷。结果发现肌苷在诱导或抑制CD4+TH1T细胞分化方面的作用是环境依赖的。在存在外源性IFN-γ的情况下，肌苷显著促进幼稚T细胞向TH1分化，在没有IFN-γ时，肌苷抑制TH1分化。而用肌苷受体高亲和力抑制剂ZM完全抵消了肌苷的效应，添加可进入细胞的二丁酰环单磷酸腺苷（db-cAMP），它是肌苷受体的下游信号分子，它能在不需要肌苷的情况下促进TH1的分化，而抑制cAMP的下游效应分子PKA能够阻断肌苷对TH1分化的促进作用。肌苷-受体-cAMP-PKA信号通路导致转录因子cAMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化，而这个CREB是一个已知的TH1关键分化因子的转录增强子。

在体实验验证了腹腔注射肌苷能够增加T-bet+IFN-γ+的CD4+T细胞及CD8+T细胞的比例。

接下来验证了假长双歧杆菌对ICB的促进作用是否需要在T细胞上特异性表达肌苷受体A2AR，将MC38肿瘤注射到假长双歧杆菌单定植的R1G-1缺陷小鼠，将A2AR敲除鼠或WT小鼠的T细胞移植给该小鼠，并给与抗CTLA-4处理，发现T细胞上A2AR的表达缺失会消除假长双歧杆菌对ICB的促进作用。

接下来研究肌苷能否在不存在假长双歧杆菌的情况下单独促进ICB的抗肿瘤效应。在无菌小鼠的肿瘤模型中口服或者腹腔注射肌苷，再给与抗CTLA-4处理，发现口服的及腹腔注射的肌苷都能减轻肿瘤重量并且增强抗肿瘤免疫，但是在没有CPG的情况下，肌苷增加了肿瘤的重量，抑制了抗肿瘤免疫，CPG是人工合成的一种寡脱氧核苷酸(ODN),可模拟细菌DNA刺激多种哺乳动物包括人的免疫细胞。它能直接激活B细胞和单核细胞(巨噬细胞和树突状细胞),间接激活NK细胞和T细胞等多种免疫效应细胞,增强其功能和细胞因子的分泌,增强抗原的加工、提呈，诱导Th1型免疫应答,产生较强的体液免疫和细胞免疫,增强特异性和非特异性免疫反应。是一种广泛应用的免疫佐剂。之一结果也证实了之前体外实验的结论，即：肌苷的作用是环境依赖且基于共刺激的存在的。

在移植了A2AR敲除T细胞的RAG1缺陷鼠的肿瘤模型中，经口给肌苷并不能诱导抗肿瘤免疫，这些结果表明：假长双歧杆菌的ICB促进作用是由肌苷介导的，并依赖于T细胞中特异性的肌苷受体A2AR信号。

接下来研究了肌苷能否在有复杂菌群存在的情况下促进ICB的抗肿瘤效应。使用了由以上十二种细菌组成肠道菌群的悉生动物模型，这十二种菌里面不包括假长双歧杆菌，发现肌苷能在这个悉生动物模型里减小肿瘤并且激活抗肿瘤免疫反应；在SPF小鼠里也有同样的作用，并且在SPF小鼠中，只有活的假长双歧杆菌有ICB促进作用，加热灭活的菌没有抗肿瘤作用。

最后验证了肌苷能否在别的肿瘤模型中增强ICB治疗的抗肿瘤效应。在Msh2LoxP/LoxPVillin-Cre小鼠中，这是一个肠上皮自发腺癌的模型，口服的肌苷能够显著降低肿瘤的重量并且增加抗肿瘤免疫反应。

之后分别在小鼠膀胱癌及异位黑色素瘤的两个模型中都得出了同样的结论。即肌苷能够促进ICB治疗的抗肿瘤效应。

总结

本文确定了从ICB治疗的CRC肿瘤中分离出的假长双歧杆菌菌株是一种关键的共生肠道细菌，它能够增强cDC依赖性的TH1细胞回路，从而极大增强ICB在小鼠肠道和上皮肿瘤模型中的作用。这些数据表明：通过改变菌群或靶向细菌治疗可能为CRC和其他癌症中的ICB提供一种有效的辅助治疗。并且本文发现的促进icb的三种细菌也在人体中有发现。此外，分析了已发表的人类粪便微生物组元基因组数据集，发现了，与无响应的癌症患者相比，有响应的患者中假长双歧杆菌的富集。本文发现肌苷是一种关键的细菌衍生代谢物，通过T细胞特异性的A2AR信号通路促进TH1细胞活化，并依赖于环境。

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