专业文不同剂量长双歧杆菌对抗生素诱导大鼠

作者

孟艳鸽，李岩中国医院消化内科，辽宁沈阳

来源

中国微生态学杂志年3月第27卷第3期-转

摘要

目的观察不同剂量长双歧杆菌对抗生素诱导大鼠腹泻及肠道菌群失调的调节作用。

方法按体表面积予头孢曲松钠钠腹腔注射诱导大鼠腹泻及肠道菌群失调，然后灌胃不同剂量的长双歧杆菌菌粉，观察治疗后大鼠肠道菌群数量、B/E值和血清内毒素的变化。

结果予头孢曲松钠钠处理后，大鼠肠道内双歧杆菌数量明显减少，肠球菌异常增殖，B/E值明显下降，血清内毒素升高，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。高倍剂量治疗组肠道内细菌数量恢复程度及B/E值改善程度显著优于低倍剂量组。长双歧杆菌各治疗组的血清内毒素含量无明显改善，与自然恢复组之间无差异。

结论头孢曲松钠可诱导大鼠肠道菌群失调。高倍剂量长双歧杆菌对头孢曲松钠所致肠道菌群失调效果更佳，短期应用不能明显改善头孢曲松钠诱发的内毒素血症。

关键词

长双歧杆菌;不同剂量;抗生素;肠道菌群失调;内毒素;B/E值

中图分类号

Ｒ.

文献标识码

A

文章编号

-X()03-0-04

DOI编码

10./j.cnki.cjm.03009

近年来，广谱抗生素在临床广泛应用，由此带来的肠道菌群失调愈发严重，主要表现在有益菌如双歧杆菌等数量的减少，机会致病菌如难辨梭状芽胞杆菌等增多，如何调整抗生素相关的肠道菌群失调成为临床研究重点之一。长双歧杆菌为严格厌氧菌，通过外源性直接补充有益菌，可降低肠道pH，抑制致病菌的生长繁殖，达到调节肠道菌群失调和改善肠道微环境的效果。本实验通过建立抗生素诱导肠道菌群失调的大鼠模型，进一步观察不同剂量长双歧杆菌对肠道菌群及血清内毒素的影响，旨在探讨不同剂量的益生菌对抗生素相关性肠道菌群失调的影响，为临床应用益生菌治疗抗生素相关性腹泻提供基础参考依据。

1材料与方法1.1材料

1.1.1实验动物健康清洁级雄性SD大鼠，80只，体重(±20)g，由中国医院实验动物中心提供［许可证号:SCXK(辽)3-］。

1.1.2实验试剂头孢曲松钠钠(罗氏芬)1.0g，上海罗氏制药有限公司，国药准字H。长双歧杆菌6-1株冻干粉3×CFU/g，自贝飞达中分离，由晋城海斯制药有限公司提供，批号90601。双歧杆菌培养基(BBL)、乳酸杆菌培养基(MＲS)、肠杆菌培养基(EMB)、肠球菌培养基及细菌生化鉴定管均购自青岛日水生物技术有限公司。大鼠内毒素酶联免疫检测试剂盒购自美国ＲD公司(ＲatETELISAKit，ＲEF:DZE，LOT:)。

1.2方法1.2.1动物分组和模型的建立1.2.1.1动物分组取雄性SD大鼠80只，清洁级，体重(±20)g，适应性饲养3d后，随机分为A～H共8组:A组:生理盐水(NS)对照组，B组:模型组直接处死，C组:模型组自然恢复，D组:模型组予长双歧杆菌mg治疗，E组:模型组予长双歧杆菌mg治疗，F组:模型组予长双歧杆菌10mg治疗，G组:模型组予长双歧杆菌1mg治疗，H组:模型组予长双歧杆菌0.1mg治疗。1.2.1.2动物模型的建立按照不同动物用药量换算方法［1］，予头孢曲松钠钠mg/kg(用生理盐水稀释后配置成2mL/只)腹腔注射，2次/d，共7d。模型建立成功的标准:主要标准———取大鼠结肠内容物菌群分析，双歧杆菌及乳酸杆菌减少甚至消失，肠杆菌及肠球菌不下降或下降比例小于双歧杆菌及乳酸杆菌，B/E值显著下降，停药1周后肠道菌群不能恢复正常为造模成功;次要标准———大鼠粪便性状和次数发生改变，按布里斯托大便分类法，将第五～七型判定为腹泻。1.2.2给药方法模型建立成功后按照分组给药:生理盐水组予生理盐水3mL灌胃，2次/d，共7d，其余治疗组将菌粉溶于生理盐水3mL中灌胃，2次/d，共7d。1.2.3观察指标1.2.3.1肠道微生物培养与检测方法用10%水合氯醛溶液按0.3mL/g腹腔注射将大鼠麻醉后，无菌留取结肠内容物标本0.1g，溶于0.9mL生理盐水中，充分震荡制成均匀混悬液，并连续进行10倍稀释至10-6，分别取不同稀释度的标本液10μL，用“L”棒均匀涂抹于BBL、MＲS、EMB和肠球菌培养基上，每个稀释浓度涂3个培养皿。BBL和MＲS平皿于37℃厌氧培养48h，EMB和肠球菌平皿于37℃需氧培养24h。培养结束后，挑取典型菌落直接涂片染色镜检并应用生化鉴定管进行细菌鉴定。确定目的菌后，参照光冈法［2］计数出标本中各种菌的菌落总数，计算出双歧杆菌及肠杆菌菌落对数值之比，即B/E值———用来评价肠道微生物的定植抗力［3］，同时计算出各种细菌含量。细菌含量(CFU/g)=稀释倍数×菌落数×［稀释液量(ml)+标本重量(g)］/标本重量(g)［4］。1.2.3.2血清内毒素含量测定方法大鼠麻醉后于无菌条件下取下腔静脉血3mL，r/min，离心15min分离血清，使用酶联免疫检测试剂盒测定内毒素含量，实验步骤严格按照试剂说明书操作。1.2.4统计学分析所有数据均用SPSS19.0软件统计分析，计数资料以均数±标准差()表示，采用不同的t检验;计量资料以率表示，采用χ2检验。P＜0.01或P＜0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1头孢曲松钠钠对大鼠的影响

2.1.1头孢曲松钠钠对大鼠粪便性状的影响模型组在头孢曲松钠腹腔注射7d后腹泻率为80%～%，明显高于生理盐水对照组，差异对比有统计学意义(见表1)。

2.1.2头孢曲松钠钠对大鼠肠道菌群的影响头孢曲松钠腹腔注射7d后，模型处死组双歧杆菌、乳酸杆菌数量明显下降，肠球菌数量明显增加，肠杆菌轻度下降，肠道内以肠杆菌和肠球菌为主，B/E值明显下降，肠道菌群严重失调。与生理盐水组相比，各种细菌数量及B/E值差异具有统计学意义(见表2)。

2.1.3头孢曲松钠钠对大鼠血清内毒素含量的影响与生理盐水组相比，模型处死组大鼠内毒素含量明显升高，差异具有统计学意义(见表2)。

2.2长双歧杆菌对菌群失调大鼠的治疗效果

头孢曲松钠造模成功后予长双歧杆菌治疗，7d后模型各治疗量组腹泻率均明显下降，自然恢复组略有下降，但未恢复至正常水平，各组腹泻率与治疗前对比差异具有统计学意义(见表1)。对肠道菌群分析，治疗7d后，模型组大鼠肠道内双歧杆菌数量显著增加，肠球菌显著下降，肠杆菌及乳酸杆菌略有变化，B/E值显著升高。模型组双歧杆菌和肠球菌变化程度明显大于自然恢复组，但各组肠道菌群数量均未恢复至正常水平，差异具有统计学意义(见表3)。各组治疗后血清内毒素含量较模型处死组无显著下降，与自然恢复组相比差异无统计学意义(见表3)。

2.3不同剂量长双歧杆菌治疗效果的差异

对各组肠道菌群分析，与自然恢复组相比，1.0g组、mg组、10mg组双歧杆菌数量、肠球菌数量及B/E值变化差异有统计学意义，1mg组、0.1mg组差异无统计学意义;但各组与治疗前相比，菌群数量和B/E值变化差异均有统计学意义(表3)。

3讨论

肠道菌群是机体的重要器官之一，其细菌数量及种类受多种因素影响，年龄、感染、肿瘤、免疫抑制等都可以诱发肠道菌群失调，尤其是抗生素的滥用和过度应用［5］。头孢曲松钠钠为广谱三代头孢菌素类抗生素，对多数革兰阳性菌和阴性菌都有强大的抗菌作用，是诱发抗生素相关肠道菌群失调的重要抗生素之一［6］。本实验应用头孢曲松钠钠腹腔注射成功诱导了大鼠肠道菌群失调及腹泻模型。造模后对结肠内容物进行菌群分析，发现双歧杆菌及乳酸杆菌明显减少，其中以双歧杆菌减少为主;肠杆菌数量略有下降，肠球菌数量明显增加，这可能与肠球菌对头孢曲松钠耐药［7］，肠杆菌对头孢菌素的耐药率也逐年增加有关。研究表明，在1－3年中有48%～56%的肠杆菌对三代头孢菌素中介或耐药［8］;而年中国CHINET肠杆菌属细菌耐药性监测发现，肠杆菌属对头孢菌素的耐药率达34.3%～89.0%［9］。造模后B/E值明显下降，表明肠道定植抗力明显降低［3］。模型组大鼠自然恢复1周后再次分析肠道菌群，双歧杆菌数量较前略有增加，但仍未恢复至正常水平，肠球菌数量较空白对照组仍有升高，B/E值仍降低，说明抗生素对肠道菌群的影响持续存在，若不予干涉治疗，肠道菌群自然恢复的周期较长。

双歧杆菌为专性厌氧菌，是肠道内的优势菌群，也可称之为有益菌。双歧杆菌可与其他厌氧菌共同构成肠黏膜的微生物屏障，阻止致病菌的入侵并抑制有害物质如吲哚、胺等的产生，维持肠道微生态平衡［10］。长双歧杆菌是双歧杆菌的一种，可以直接补充肠道有益菌，调整肠道菌群失调。本实验模型组予长双歧杆菌灌胃治疗7d后，对其肠道内容物进行菌群分析表明，与治疗前及自然恢复组相比，双歧杆菌及乳酸杆菌数量明显增加，以双歧杆菌为主，肠杆菌及肠球菌数量下降，B/E值升高，证实长双歧杆菌对抗生素诱导的大鼠肠道菌群失调有显著调节作用。但各治疗组与生理盐水组相比，肠道细菌数量和B/E值仍未完全恢复，推测可能原因是治疗周期较短，也可能与长双歧杆菌菌粉经过大鼠胃液消化后活菌数减少相关。本实验应该活菌冻干粉调节菌群失调效果显著，但并未对长双歧杆菌经过胃液之后的消长趋势和其在肠道的定植时间进行观察，需要进一步的实验研究来解释。

本实验首次严格按照活菌数进行浓度梯度分组，对不同浓度长双歧杆菌治疗效果的差异进行比较，首先对腹泻率分析，高倍剂量组腹泻率明显低于低倍剂量组，治疗7d后腹泻率明显低于治疗3d，差异对比有统计学意义(见表1);其次对肠道菌群分析表明，高倍剂量组肠道内双歧杆菌及B/E值增加程度明显大于较低倍剂量组，肠球菌数量下降程度更明显;再次证实高倍剂量的长双歧杆菌对抗生素诱导的肠道菌群失调治疗作用效果显著优于低倍剂量，这与既往类似研究结果一致［11］，推测同等治疗周期内高倍剂量长双歧杆菌疗效显著，可能缩短疗程。

内毒素是革兰阴性杆菌的代谢产物，能在肠道内不断产生，正常情况下，肠道菌群提供微生物屏障，将内毒素局限在肠腔内［12］。当抗生素导致肠道菌群失调时，肠腔内双歧杆菌数量减少，而肠球菌数量增加，导致内毒素产生增多;同时有研究［3］发现抗生素的使用会导致回肠、盲肠的肠间质水肿和上皮绒毛脱落，破坏了肠黏膜机械屏障，导致内毒素入血。本实验对大鼠血清内毒素检测结果表明，模型组内毒素含量较生理盐水组升高，予长双歧杆菌治疗后血清内毒素无继续升高也无明显下降，自然恢复组与各模型组差异无统计学意义。表明短期应用长双歧杆菌可以调整肠道菌群，抑制内毒素通过肠壁进一步扩散，但并不能迅速降低血清内毒素，据此推测短期应用长双歧杆菌对改善肠壁水肿及促进脱落上皮的再生作用不显著，若要治疗抗生素导致的内毒素血症，可能需要延长疗程。

本实验再次证实抗生素可以诱发肠道菌群失调，应用益生菌可以有效的调节肠道微生态环境，且高倍剂量的治疗效果更佳;同时发现抗生素可以诱发肠源性内毒素血症，予益生菌治疗可以阻止其继续加重，但短期内应用无明显改善作用，高低剂量的治疗效果无差异。

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