肠道菌群的研究方法和技术肥胖及糖尿病

赵立平张晨虹上海医院

　　目前，肠道菌群研究炙手可热，大量临床医生希望能开展这方面的研究，但对相关研究方法可能不太了解。我现结合我们团队开展的工作，与大家共同探讨这些研究方法。

　　肠道菌群简介

　　人体中定植着大量微生物，重量可达1~2kg，而其中90%位于肠道中，肠道菌群细菌数量是人体细胞数量的10倍左右，其所携带的基因数是人体自身基因的倍。肠道菌群基因组信息的总和被称为肠道元基因组或宏基因组（metagenome），是控制人体健康的第二基因组，与人体自身基因组在外界环境如药物和食物的共同作用下，共同影响着机体的生理代谢。因此，人体可视为人体真核细胞和体内共生的微生物群落共同构成的“超级生物体（supraorganism）”。

　　肠道菌群是肥胖防治领域的研究热点

　　目前，全球肥胖流行非常严重，引起了各国科学家的广泛重视，很多研究团队都在开展肠道菌群与肥胖方面的研究。研究发现，肠道菌群和肥胖关系密切，肥胖患者与正常体重的健康人体内肠道菌群的结构和组成有所不同。一方面，美国JefferyGorden小组发现肠道菌群可影响宿主脂类合成和代谢相关基因，直接调控基因表达，从而影响脂肪积累[1]；另一方面，欧洲的科学家PatrickCani及其同事指出不当饮食破坏肠道菌群的构成和组成，肠道菌群产生的一些抗原类物质如脂多糖（LPS）进入宿主的循环系统中，可诱发慢性炎症，从而导致胰岛素抵抗和肥胖等[2,3]。若将肥胖患者和正常人的肠道菌群转移至无菌小鼠体内，肥胖患者的肠道菌群会引起无菌小鼠的脂肪过度积累[4]。

　　与人肠道菌群有关的研究迄今已开展十几年，所有科学家都 　　重度肥胖患者的肠道菌群研究

　　我们曾治疗1例重度肥胖患者，治疗前体重.9kg，体重指数（BMI）58.8kg/m2，给予其全谷物、传统中药和益生元（WTP）的膳食干预，为期23周，干预结束时，患者体重降至.5kg，BMI41.5kg/m2。这例患者基线时有高血压、高血脂、高血糖等，所有代谢指标均高于正常范围，但经过膳食干预后，各项指标都恢复到正常范围，而且分别反映内毒素负荷和炎症状态的脂多糖蛋白（LBP）和白介素-6水平均降低。对其菌群进行指纹图谱分析显示，患者接受干预之前，某种革兰氏阴性条件致病菌水平高达35%，而干预之后降至0.5%，几乎检测不到。

　　这类细菌在肥胖发病中是否发挥了非常重要的作用？为探讨这一问题，我们进行了元基因组测序。分析发现，膳食干预后，患者体内产生LPS的革兰氏阴性细菌丰度下降，且毒性水合成通路也减少。以序列为指导的分离干预前水平较高的细菌，经鉴定发现为阴沟肠杆菌，我们将其命名为阴沟肠杆菌B29（以下简称“B29”）。

　　将这种菌株移植到无菌肥胖小鼠模型中，分为正常饮食+无菌、正常饮食+B29、高脂饮食+无菌、高脂饮食+B29、高脂饮食+双歧杆菌（对照组）五组。无菌小鼠能够抵抗高脂饮食引发的肥胖，而移植了B29的无菌小鼠饲喂高脂饮食则出现血清LBP水平显著增加，16周时脂肪积累显著，肝脏和脂肪垫的局部炎症反应增加，血脂代谢失调。但是并不是任何一种细菌都能够引起无菌小鼠肥胖，移植了双歧杆菌的无菌小鼠未发生肥胖，体重反而下降。

　　因此，我们在肥胖患者体内分离到一株能够产生内毒素的条件致病菌B29，移植至无菌动物体内，在无菌动物中复制出了脂肪积累、炎症、胰岛素抵抗等症状，在国际上首次按照科赫法则证明了B29能够引起肥胖。

　　总结

　　在肠道菌群研究方面，通过元基因组测序可以获知肠道菌群的结构和组成及丰度比例，并通过基于冠层的汇集方法能将这些基因拼接出许多高质量的新基因谱，从而知道它们之间的相互关系；另外，通过代谢组学分析，可找出细菌和宿主的共代谢产物；将元基因组和代谢组数据进行关联分析，能够找出到底哪些细菌产生的这些产物，以及携带有产生这些物质的基因。这些方法有助于阐明肠道菌群在疾病发生发展中的作用。

　　参考文献：

　　1.BackhedF,etal.Thegutmicrobiotaasanenvironmentalfactorthatregulatesfatstorage.ProcNatlAcadSciUSA.Nov2;(44):-.

　　2.CaniPD,etal.Metabolicendotoxemiainitiatesobesityandinsulinresistance.Diabetes.Jul;56(7):-.

　　3.CaniPD,etal.Changesingutmicrobiotacontrolmetabolicendotoxemia-inducedinflammationinhigh-fatdiet-inducedobesityanddiabetesinmice.Diabetes.Jun;57(6):-.

　　4.RidauraVK,etal.Gutmicrobiotafromtwinsdiscordantforobesitymodulatemetabolisminmice.Science.Sep6;(6):.

（来源：《国际糖尿病》编辑部）

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