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口腔微生物如何影响肠道菌群的
1文章介绍
英文题目：OralAdministrationofP.gingivalisInducesDysbiosisofGutMicrobiotaandImpairedBarrierFunctionLeadingtoDisseminationofEnterobacteriatotheLiver
中文题目：口服P.gingivalis导致肠道菌群失调、屏障功能受损进而诱导肠道菌群向肝脏的转移
期刊名：PLOSone发表时间：IF：3.
物种：C57BL/6型鼠样品来源：小鼠粪便、血液、肝脏、大肠、小肠
相关产品：16S多样性测序
测序平台：
2研究背景
牙周炎被认为是各种系统性疾病的危险因素，然而牙周炎引起系统性疾病的确切机制还有待阐明。Porphyromonasgingivalis是诱发牙周炎的致病菌，研究发现重复服用P.gingivalis能够扰乱肠道菌群，进而引发内毒素血症，产生各种系统性炎症和胰岛素抗性。但是P.gingivalis的使用剂量达到何种水平，才能够影响肠道菌群的组成、破坏屏障功能，致使菌群由肠道转移到肝脏，目前还不得而知。
3研究内容
本研究对C57BL/6型小鼠进行P.gingivalis灌喂实验，并结合平台微生物多样性测序手段，探究肠道及肝脏中菌群的变化情况。结果表明，P.gingivalis能够导致血液内毒素含量升高，诱导肠道菌群发生改变，降低肠道中紧密连接蛋白基因的表达量。此外，研究还揭示了系统性炎症与肠道菌群变化的因果关系，P.gingivalis感染会扰乱肠道菌群，进而引发各种系统性疾病，即肠道菌群的改变先于系统性炎症的发生，这一假设打破了传统的认知：系统性炎症是导致肠道菌群变化的原因。
4研究方法
小鼠选择
取6周龄C57BL/6型雄性小鼠，放在特定的无菌条件下饲养，定期饲喂食物和无菌水，使之适应新环境，7周后用于P.gingivalis感染实验。
P.gingivalis培养
将P.gingivalis接种到改造过的厌氧培养基GAM上，放入厌氧罐中，37℃培养48h。
灌喂处理
通过针管喂食的方法将混有P.gingivalis的20%羧甲基纤维素的PBS注入到小鼠口腔中，P.gingivalis的注入量根据小鼠体重和牙周炎患者唾液中的细菌数量决定。对照组注射不含有P.gingivalis的20%羧甲基纤维素的PBS。所有小鼠经过正常饮食，然后分别在3h、24h、48h后用CO2处以安乐死。
粪便、组织收集与DNA提取
在小鼠感染P.gingivalis后的6h、24h、48h，分别收集粪便样品，并提取粪便中的DNA。在小鼠感染P.gingivalis后的3h、24h、48h分别收集小鼠肝脏组织和血液，并提取DNA。
血液内毒素检测
收集P.gingivalis感染48h后的小鼠血清，稀释1-4倍，之后对血清中的内毒素进行定量检测。
肠中基因的表达定量
提取P.gingivalis感染24h和48h后小鼠的小肠和大肠组织中RNA，反转成cDNA，PCR扩增形成mRNA待用。
测序
采用平台，对每个样品进行细菌16S微生物多样性测序。
5研究结果
口服P.gingivalis对肠道菌群的影响
研究发现P.gingivalis感染后，在0-6h肠道菌群基本无变化，24h后开始出现差异，48h后差异达到显著，因此后续对肠道菌群的研究都是基于48h后的粪便样本结果。结果显示，在门水平上，相比正常组，P.gingivalis感染组的拟杆菌门（Bacteroidetes）显著增加而厚壁菌门（Firmicutes）显著降低。在属水平上，同属Paraprevotellaceae家族的S24-7和Prevotella显著增加，而厚壁菌门下的unclassifiedClostridiales却显著减少。此外，Chao1曲线显示虽然P.gingivalis感染并不会影响肠道菌群的多样性，但由PCoA分析可见P.gingivalis确实对肠道菌群的结构产生了显著影响。
图1.P.gingivalis感染48h后小鼠肠道菌群门水平（A）和属水平（B）的相对丰度变化分析
图2.多样性指数Chao1分析（A）；P.gingivalis感染和未感染小鼠粪便菌群的PCoA分析（B）
口服P.gingivalis对肠道菌群屏障功能的破坏
紧密相关蛋白编码基因Ocln和Tjp1在肠道功能屏障中发挥着重要的作用，若Ocln和Tjp1表达被抑制，就会导致肠道屏障功能受损，肠道中的菌群则会涌入到肝脏中。研究发现，P.gingivalis感染48h后，Ocln和Tjp1在小肠中的表达量明显降低，但在大肠中却未见此现象。此外，通过检测肝脏中16srRNAgene的拷贝数，发现P.gingivalis感染后肝脏菌群明显增多，而血液中的菌群基本无差异，但是血液中的内毒素含量却显著增加。
图3.P.gingivalis感染48h后小肠中紧密相关蛋白编码基因Ocln和Tjp1的表达分析（A）；P.gingivalis感染后小鼠肝脏和血液中的菌群丰度变化分析（B）；P.gingivalis感染后内毒素含量变化分析（C）
口服P.gingivalis对肠中促炎基因高表达的诱导
P.gingivalis感染24h后肠中基因的表达无变化，然而48h后，小肠中IL-6的表达显著增高，同时，Th17细胞的转录因子Roryt，其mRNA的表达也被明显抑制。此外，IFN-α和-β，促炎基因IL-1β和IFN-γ以及调节T细胞的主基因Foxp3的表达也有上调趋势，尽管差异不是很显著。同小肠一致，大肠中基因的表达也是在P.gingivalis感染24h后开始出现差异，其中TNF-α的表达显著增高，导致Foxp3也相应增高，而其它促炎基因表达基本无变化。总之，P.gingivalis感染后无论小肠还是大肠，都会诱导促炎基因的大量表达，并引发相应的炎症。
图4.P.gingivalis感染和未感染小鼠小肠（A）和大肠（B）中促炎基因的表达分析
口服P.gingivalis对肝脏菌群组成的影响
在上述研究中已经得知P.gingivalis感染后，肝脏菌群的丰度发生了显著增高，那么肝脏菌群的组成情况有没有发生改变呢？测序研究结果表明，在门水平上，虽然两组没有显著差异，但是拟杆菌门仍有上升趋势而厚壁菌门呈下降趋势。在属水平上，Paraprevotellaceae门下的Prevotella比例升高，而Allobaculum和Akkermansia比例则趋于下降。此外，从Chao1曲线和PCoA分析结果也可见P.gingivalis感染对肝脏菌群的多样性及组成均产生了显著影响。
图5.P.gingivalis感染后小鼠肝脏菌群门水平（A）和属水平（B）的相对丰度变化分析
图6.多样性指数Chao1分析（A）；P.gingivalis感染和未感染小鼠粪便菌群的PCoA分析（B）
6参考文献
NakajimaM,ArimatsuK,KatoT,etal.OralAdministrationofP.gingivalisInducesDysbiosisofGutMicrobiotaandImpairedBarrierFunctionLeadingtoDisseminationofEnterobacteriatotheLiver[J].PLoSONE,,10(7):e.Doi:10./journal.pone..
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