柴归颗粒对慢性不可预知温和刺激抑郁大鼠模

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摘要：目的利用16SrRNA高通量测序技术研究柴归颗粒对慢性不可预知温和刺激（chronicunpredictedmildstress，CUMS）抑郁大鼠模型肠道菌群的调节作用，探讨柴归颗粒的抗抑郁作用及机制。方法SD大鼠随机分为对照组、模型组和柴归颗粒（8.3g/kg）组，给药1h后造模，持续28d。收集大鼠肠道内容物，提取总DNA，根据细菌16SrRNAV3～V4区设计引物进行扩增，利用IlluminaMiseq平台进行高通量测序。结果与对照组比较，模型组大鼠肠道菌群栖热菌门（Thermi）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）相对丰度水平显著降低（P＜0.05），乳酸杆菌属Lactobacillus相对丰度水平显著升高（P＜0.05），栖热菌属Thermus、不动杆菌属Acinetobacter、甲基杆菌属Methylobacterium、青枯菌Ralstonia、纤毛菌属Leptothrix、假单胞菌属Pseudomonas、棒状杆菌属Corynebacterium和苍白杆菌属Ochrobactrum相对丰度水平显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，柴归颗粒可调节CUMS大鼠肠道菌群的构成，显著回调栖热菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门相对丰度水平（P＜0.05、0.01），显著降低乳酸杆菌属相对丰度水平（P＜0.01），显著升高栖热菌属、不动杆菌属、甲基杆菌属、青枯菌属、纤毛菌属和苍白杆菌属相对丰度水平（P＜0.01）。结论柴归颗粒可能通过调节参与精氨酸代谢途径的肠道菌群发挥抗抑郁作用。

抑郁症属于情感性心境障碍，已成为严重影响患者身心健康的重大疾病，其发病率逐年增加，患病人数已超过3亿，约占世界人口的4.4%[1]。但其病因和发病机制尚不清楚，现有抗抑郁药物的临床疗效不佳且不良反应明显，因此被列为重大疑难疾病之一。近年来，越来越多的研究报道肠道和大脑之间拥有一个包含内分泌、免疫、自主神经和肠神经等的双向通讯系统。肠道菌群与大脑之间的关系对抑郁症具有一定的影响，研究发现抑郁患者的粪便菌群组成与健康受试者存在明显差异[2]；抑郁患者的粪便菌群移植到无菌小鼠可诱发抑郁样行为[3]；抗抑郁药氟西汀、文拉法辛等可明显调节抑郁患者的肠道菌群组成[4-6]；逍遥散可通过调节肠道菌群来改善慢性不可预知温和刺激（chronicunpredictedmildstress，CUMS）大鼠的抑郁样行为[7]。

柴归颗粒是课题组前期对宋代《太平惠民和剂局方》中的经典方剂逍遥散进行抗抑郁组分筛选和化学成分分析，通过药效学研究和临床试验观察，对原方进行化裁而研发的抗抑郁中药新药，处方由柴胡、当归、白芍、麸炒白术、炙甘草和薄荷组成。柴归颗粒的离体肠吸收特性研究发现，柴归颗粒可成倍增加甘草查耳酮B和异甘草素在CUMS大鼠肠道的吸收，甘草查耳酮B和异甘草素是有效的抗抑郁活性成分[8]。柴归颗粒中含有的柴胡皂苷、白术内酯、香草酸、芍药苷、芍药新苷、芍药内酯苷、Z-丁烯基苯酞和甘草次酸均已被报道具有抗抑郁作用，可能是柴归颗粒发挥抗抑郁作用的有效成分，柴归颗粒已获得国家药物临床试验批件（L），目前正在开展药物临床试验研究。课题组前期研究发现，柴归颗粒具有改善抑郁大鼠伴发的学习记忆能力下降、焦虑情绪和胃肠功能障碍的作用，推测柴归颗粒可能通过调节肠道菌群来改善胃肠功能和抑郁样行为。因此本研究采用16SrRNA高通量测序技术，分析柴归颗粒对CUMS大鼠肠道菌群组成的影响，阐明柴归颗粒通过调节肠道菌群结构组成从而发挥抗抑郁作用的机制，为治疗抑郁症及抗抑郁药物的研究提供科学依据。

1材料

1.1动物

SPF级雄性SD大鼠，8周龄，体质量～g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京-）。动物于室温（22±2）℃，相对湿度（50±10）%，自然昼夜节律饲养，自由饮食和饮水。动物实验通过山西大学科学研究伦理委员会批准（批准号SXULL-009）。

1.2药材

柴归颗粒（批号9）由柴胡16.38kg、当归16.38kg、白芍16.38kg、麸炒白术16.38kg、炙甘草8.19kg、薄荷5.46kg组成，由山西省中医研究院制剂中心制备。以上药材均购于山西省华阳药业有限公司，经山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定分别为柴胡BupleurumchinenseDC.、当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels、白芍PaeonialactifloraPall.、白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.、甘草GlycyrrhizauralensisFisch.和薄荷MenthahaplocalyxBriq.，均符合《中国药典》年版标准。

1.3药品与试剂

琼脂糖凝胶（批号-）、琼脂糖凝胶电泳缓冲液（批号AM）、Quant-iTPicoGreendsDNAAssayKit（批号P）购自美国Invitrogen公司；Marker（批号DL0）购自日本Takara公司；Q5?High-FidelityDNA聚合酶（批号ML）购自美国NEB公司。

1.4仪器

CentrifugeTDL-5高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；BSAS电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；大鼠旷场测试箱（长cm、宽cm、高70cm，黑色，25格，实验室自制）；KQ-KDE超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；NC0Nanodrop紫外定量仪（美国ThermoScientificFisher公司）；DYY-6C电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；BG-gdsAUTO（）凝胶成像系统（北京百晶生物技术有限公司）；PCR扩增仪（美国ABI公司）；FLXT酶标仪（美国BioTek公司）；Miseq测序仪（美国Illumina公司）。

2方法

2.1动物分组与给药

大鼠适应性饲养1周后，进行糖水偏爱实验、旷场测试和体质量基线测试，并随机分为对照组、模型组、柴归颗粒（8.3g/kg，以生药量计）组，每组10只。药物溶于蒸馏水，柴归颗粒组ig药物（10mL/kg），对照组和模型组ig等体积蒸馏水，1次/d，给药1h后造模，持续28d。

2.2CUMS模型的建立

参照Willner[9]及本课题组方法[10]，CUMS模型使用9种刺激因子，包括冰水浴、热刺激、禁食、禁水、超声刺激、夹尾、束缚、足底电击、昼夜颠倒，每天随机给予1种应激，保证同一刺激不连续出现，持续28d。

2.3样本收集

给药及造模28d后，大鼠禁食不禁水12h，ip10%水合氯醛（5mL/kg）麻醉[11]，腹主动脉取血后处死，收集肠道内容物于灭菌冻存管中，液氮中速冻，随后转移至?80℃超低温冰箱保存备用。

2.SrRNAV3～V4区高通量测序

2.4.1DNA样本的提取与扩增以行为学指标为依据，每组筛选6只大鼠进行高通量测序。取大鼠肠道内容物mg，提取细菌总DNA，采用Nanodrop对DNA进行定量分析，通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度。扩增目的片段为V3～V4区，上游引物序列为5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，下游引物序列为5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。PCR条件为98℃预变性30s，98℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共27个循环，72℃扩展延伸5min。

2.4.2PCR产物定量使用Quant-iTPicoGreendsDNAAssayKit对PCR产物在Microplatereader进行荧光定量。根据荧光定量结果，按照样本的测序量，对样本按相应比例进行混合。

2.4.3Miseq测序采用Illumina公司的TruSeqNanoDNALTLibraryPrepKit制备测序文库，使用MiseqReagentKitV3测序仪进行2×bp的双端测序。利用Flash软件（

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