中风引起的快速肠道生态失调依次加重脑梗死

中风是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因。神经保护方法在临床试验中失败了，因此需要用替代靶点进行治疗创新。肠道微生物区系是导致中风的许多危险因素的重要因素。然而，中风和肠道微生物区系之间的双向相互作用在很大程度上仍不清楚。

01

肠杆菌科细菌增多是急性缺血性卒中患者康复早期的独立危险因素

作者招募了两个独立的缺血性卒中患者队列，以探讨肠道菌群失调的动力学及其与卒中结局的相关性。根据基于加权UniFrac距离的主坐标分析(PCoA)，急性期(T1和T2)和亚急性期(T3)的微生物群落结构与健康对照组明显分开，并在恢复期(T4)恢复(图1A，B)。其中，肠杆菌科在中风后和康复后T4的增幅最大，与整个群落动态相似(图1C，D)，而拟杆菌科则表现出相反的动态趋势(图1C)。微生物组分析显示，肠杆菌科的相对丰度在治疗后7天初级结局差的组中显著富集(图1E，F)。无论是单因素分析还是多因素Logistic回归分析，肠杆菌科致病仍然显著，表明肠杆菌科是卒中患者早期预后较差的独立危险因素。

图1(A)-(D)临床队列1包括28名缺血性中风患者和28名健康对照。(A)主坐标分析显示健康对照组和缺血性中风患者急性期(T1-T2)、亚急性期(T3)和恢复期(T4)之间的肠道微生物区系组成。(B)各缺血性卒中组与对照组的距离。(C)气泡图显示，对照组和各缺血性卒中组肠道微生物α多样性。(D)对照组和所有缺血性卒中组中肠杆菌科的相对丰度。(E)-(H)临床队列2包括名预后良好或不良的缺血性中风患者。(E)气泡图在良好和较差的初级结果组之间分布明显不同的分类群。(F)肠杆菌科细菌的相对丰度。(G)缺血性卒中患者初次预后不良危险因素的单因素Logistic回归分析。(H)在调整混杂因素后，缺血性卒中患者初次预后不良的危险因素的多因素Logistic回归。

02

缺血性卒中致肠道快速失调，肠杆菌科细菌爆发

为确定卒中后肠道菌群的变化，作者进行了大脑中动脉阻塞或假手术，分别在卒中后3h、6h、12h、1d、3d和7d处死小鼠进行动态追踪。结果显示，动脉闭塞早在卒中后3小时就成功地诱导了脑梗死，从12小时开始显著增加，在1天到7天达到峰值(图2B，C)。肠道菌群随主坐标(PC1)和PC3脑梗死的增加而呈现明显而快速的动态变化。卒中后3h，回肠内容菌群即与对照组有明显差异(图2D，E)。微生物群在卒中后12h~1d达到最大偏差，7d后逐渐恢复到与对照组相似的状态。。肠杆菌科的相对丰度从正常状态下的不到1%增加到在卒中后6小时的高于10%，在卒中后12小时到1天达到最高值40%，在卒中后3天到7天逐渐恢复。

图2(A)动物实验设计。(B)所有MCAO组的脑切片。(C)对照组和各MCAO组的相关脑梗死率。(D)-(F)对照组和所有MCAO组回肠内容物样品中肠道微生物区系的时间转移，包括基于未加权UniFrac距离(D)的主坐标分析分布、主坐标3(PC3)(E)上的群落结构的时间序列分析以及科水平上的肠道微生物组成(F)。(G)-(J)空肠(G)、回肠(H)、盲肠(I)和结肠(J)中假手术组和MCAO组之间肠杆菌科细菌相对丰度的时间变化。

03

肠道生物失调与卒中所致的肠缺血和硝酸盐的产生有关

作者进一步研究发现胃肠道也经历了伴随中风的缺血(图3A，B)。并且，缺血再灌注损伤过程中三个关键基因：超氧化物产生的NOX1和DUOX2以及一氧化氮(NO)的产生的NOX2在卒中后1d均显著上调(图3D-F)。超氧化物和NO可以迅速相互作用，产生细胞毒性的过氧亚硝酸盐，进而自发转化为硝酸盐，硝酸盐是一种已知通过硝酸盐呼吸在厌氧微环境中促进肠杆菌科过度生长的化学物质。在这里，作者测定了小鼠盲肠粘液层中的硝酸盐浓度，并观察到中风后1天，MCAO组硝酸盐浓度显著高于Sham。硝酸盐水平足以诱导肠杆菌科的过度生长。除肠道菌群失调外，肠缺血再灌注损伤和过氧亚硝酸盐的产生也损害了肠屏障的完整性。紧密连接蛋白基因Tjp1、Ocln和Cldn2的相对表达以及小鼠血清中的肠道渗漏生物标志物脂多糖(LPS)和脂多糖结合蛋白(LBP)，它们也呈现出相似的时移模式，在中风后1天达到峰值。

图3(A)假手术组(n=3)和MCAO组(n=5)的激光散斑图像。(B)假手术组和MCAO组小鼠盲肠血流的ROI相关比例。(C)中风后肠缺血和再灌注引起的自由基反应的拟机制示意图。在假手术组和MCAO组)，(D)Nox1，(E)DUOX2和(F)NOS2的相对表达；(G)盲肠粘液层的硝酸盐浓度；(H)Tjp1，(I)Ocln和(J)Cldn2的相对表达；(K)血清脂多糖(LPS)和(L)LPS结合蛋白(LBP)的水平。

04

肠杆菌科细菌通过加速全身炎症加重脑梗死

为探索肠杆菌科的过度生长是否在卒中的病理生理过程中起到了作用，作者将从MCAO处理的小鼠中分离的大肠杆菌菌株接种到抗生素处理的小鼠中，与相应的仅使用抗生素的小鼠(ABX组)相比，其显著增加了脑梗死的发生(图4A，B)。RNA测序发现大肠杆菌处理组小鼠盲肠组织中涉及免疫系统过程、先天免疫反应和细胞因子反应的基因显著丰富(图4C)。大肠杆菌治疗组的小鼠血清中与全身炎症相关的生物标志物脂多糖、脂多糖、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6的浓度显著高于ABX组，从而表明肠道微生物群中大肠杆菌丰度的增加可能会加速中风后的全身炎症(图4D-H)。此外，研究结果还表明，TLR4途径相关基因，包括TLR4、Traf6、Tram、MyD88和NFkB在接种大肠杆菌的小鼠中显著上调(图4I-M)。为了验证LPS-TLR4途径的作用，作者敲除了参与完整LPS生物合成途径的waal基因。突变体接种组的脑梗死率与ABX组相当，明显低于大肠杆菌治疗组(图4A，B)。这些数据表明，肠道中大肠杆菌的过度生长可能会通过脂多糖介导的全身炎症而加剧脑梗死。

图4肠杆菌科细菌过度生长促进脑梗死。(A)动物实验设计；(B)ABX组、大肠杆菌组、ΔWaal大肠杆菌组(n=10只/组)脑梗死率。(C)对大肠杆菌组和ABX组盲肠组织进行RNA测序的热图分析显示，两组(n=5只小鼠/组)的基因表达发生了显著变化。对免疫和全身炎症途径中涉及的基因进行了注释。(D)血清脂多糖、(E)脂多糖结合蛋白、(F)肿瘤坏死因子-α、(G)白细胞介素-1(IL-1)β、(H)IL-6水平。ABX组和大肠杆菌组之间相对(I)TLR4、(J)Traf6、(K)Tram、(L)MyD88和(M)NFkB的表达。

05

抑制肠杆菌科细菌过度生长可缓解脑梗死

为了测试肠杆菌科过度生长作为治疗中风的新靶点的潜在作用，作者使用了三种针对不同途径的抑制剂：AG用于抑制iNOS介导的NO的产生，热稳定的Mn型SOD用于清除超氧化物歧化酶和钨酸钠(W)用于抑制肠杆菌科的硝酸盐呼吸。在MCAO后1小时口服，AG组和SOD组盲肠粘液层硝酸盐浓度与假手术组相当，明显低于MCAO组(图5B)。并且，这些抑制剂不仅抑制自由基的产生，而且在转录水平上显著抑制相关基因的表达(图5C-E)，提示AG、SOD和W可能通过正反馈调节恢复肠道生物失调(图5F-H)，使肠杆菌科细菌数量减少到假手术组水平(图5I-K)。更重要的是，AG、SOD和W显著降低了脑梗死率(图5L-N)，肠道菌群对于AG、SOD和W介导的卒中后脑梗死的改善是必要的(图5O)。为了证明SOD的作用是否是通过其在肠道微环境中的超氧化物歧化活性实现的，作者构建了一个SODH84A突变体，这种突变酶缺乏锰结合活性，因此不能使超氧化物歧化。与MCAO组相比，SODH84A组对脑梗死无改善作用(图5M)。作者进一步测试了AG靶向卒中的量效关系。当在中风后1小时给予AG时，AG的有效给药剂量范围为25-mg/kg，其中25mg/kg剂量表现最佳(图5P)。此外，我们通过给MCAO模型小鼠注射25mg/kgAG来测试治疗时间窗口，发现AG显著减少了中风后1小时至12小时的脑梗死(图5Q)。

图5(A)氨基胍(AG)、超氧化物歧化酶(SOD)或钨酸钠(W)干预的动物实验设计。(B)假手术组、大脑中动脉闭塞(MCAO)组、AG组、SOD组小鼠盲肠粘液层硝酸盐浓度。(C)假手术组、MCAO组和AG组之间NOS2的相对表达。(D)Nox1和(E)DUOX2在假手术组、MCAO组和SOD组之间的相对表达。盲肠内容物在假手术组、MCAO组、(F)AG、(G)SOD或(H)W组之间的分布。假手术组、MCAO组、(I)AG组、(J)SOD组、(K)W组盲肠内容物中肠杆菌科细菌相对丰度。(L)-(N)AG、SOD或W干预组的脑梗死比。MCAO组与AG组之间、MCAO组与SOD组与SODH84A组之间、MCAO组与W组之间的脑梗死比(L)。(O)ABX组、ABX-AG组、ABX-SOD组和ABX-W组之间的脑梗死率。(P)在MCAO后1h分别给予AG1、10、25、50、、mg/kg的脑梗死率。(Q)在MCAO后1h、3h、6h和12h分别给予AG25mg/kg‘的脑梗死率。

研究揭示了卒中与肠道生物失调之间的相互关系。缺血性中风迅速引发肠道微生物群失调，肠杆菌科细菌过度生长，进而加重脑梗死。

原文链接：

转载请注明：http://www.nzjgr.com/jbby/12323.html