肠道菌群面临哪些重要挑战

编者按：随着微生物组研究的不断发展，我们对肠道菌群的复杂性和多样性以及其与健康之间的关系有了更为深刻的认识，然而当前这一领域中仍存在着许多的挑战。这些挑战或将影响菌群研究的结论，甚至得到假阳性结果。那么当前菌群研究最重要的挑战有哪些？怎样解决呢？今天我们特别编译了发表在Gastroenterology杂志上关于人类微生物组研究的挑战和应对的文章。希望本文能够为相关的产业人士和诸位读者带来一些帮助和启发。人类肠道菌群的研究随着菌群非培养技术及多组学技术的迅速发展，我们对人类肠道菌群的复杂性、多样性，以及其在健康和疾病中所扮演的重要角色的认知程度逐步上升，这一神秘黑暗的领域自此走向光明。据我们所知，从健康角度来说，肠道菌群对消化系统和肠外系统的正常运行都很重要。与此同时，破坏宿主和肠道菌群之间重要双向互作形成的肠道紊乱，即肠道菌群失调，会引发或加重疾病。在细菌中发现的原核生物核糖体16SrRNA，包含保守区和可变区。随着与复杂菌群研究相关的新技术的不断发展，通过对可变16SrRNA进行测序，以确定菌群的系统分类及成员的愿景或许有希望实现。虽然这种方法提供的有用信息很丰富，并且为大多数人类菌群提供了标准化研究方法，但却无法直接提供与菌群功能、介体（mediators）及其对宿主影响有关的信息。然而，这些信息是必要的，一方面为了超越相关性描述，另一方面是为了可以更好地理解宿主-菌群互作机制。如果不考虑研究设计、取样过程及方法的内容，那么即便是新技术也会有所受限。如果要阐明宿主-菌群互作机制，事实上有很多挑战需要面对，包括临床研究上的遗传学细微差别、组织/菌群取样的次优方法以及培养/非培养技术的局限性。因此，人类肠道菌群作为一个开放性前沿，充满了许多未知性而且几乎没有先例，有待专家学者进一步探索，以更好地了解人类健康和疾病，并为提高临床实践的准确性和更好的效果提供创新解决方案。表1.人类肠道菌群研究面临的挑战及解决方法挑战：研究方案设计及实例我们首先要申明的是，人类和肠道菌群本来研究起来就比较困难。虽然横断面观察性研究有助于验证可检验假设，但如果收集并整合相关元数据的话，它们所产生的价值更大。要做到这一点，第一个关键步骤是提出一个兼具科学和临床意义的问题，其覆盖面包括知识层面、尚未探索的领域、疗法和（或）最佳实操案例。第二步是对研究过程中可能出现的问题设计研究方案。通过对研究过程中可能出现的限制因素进行预测，提供可及时应对的替代方案。在一项研究正式开始之前，这一步骤对于所有与人体相关的研究调查都是至关重要的，尤其关系到这一研究是否能顺利完成。要知道，人体研究不能轻易重复，计划不当的研究充满了未知风险。在设计人体肠道菌群研究方案时，需要考虑到几个关键因素。表1列出了与此相关的挑战。首先，肠道菌群在不同“健康”人群中的差异很大1,2，这使得肠道菌群的影响效果难以预测。横断面研究通常需要大量的受试者和菌群样本来进行分析2。根据所研究的问题，其中可能会涉及到大量的计算，这很具有挑战性，即便是对那些经验丰富的生物统计学家而言也很有难度。此类研究通常具有关联性；然而，当实验参数能够得到精确控制时，或者实验组均质化程度较高时，横断面研究能提供比较客观的结论。相反，对那些需要受试者进行自身对照并以前瞻性或纵向研究为主的小型研究项目而言，比起横断面研究所需要的大量受试者样本，这些小型研究项目往往需要的是从受试者身上得到更多更有用的信息（图1）。基于此，精心管理的临床元数据时序样本会显得更有用，并能从中找出潜在的因果关系。其次，各种混杂因素也会影响肠道菌群，包括年龄、3,4BMI指数、5,6饮食、5,7~9遗传背景、10,11性别、5,6昼夜节律、12疾病活跃度、13药物14以及地理环境。15尽管由于技术和（或）道德层面的一些原因，这些因素很难控制，但如果不加以控制的话有可能会出现假阳性结果。第三，人类粪便虽然很容易取样，但人类粪便样本中的菌群很难代表上消化道菌群，甚至连下消化道菌群都难以代表。16整个消化道的菌群组成各不相同，就连粘液与腔内层的菌群组成都有所区别。此外，结肠转运过程需要经历数小时，在此期间，肠道菌群的成员和功能都会发生变化。并且，一旦将时间关系与其他事件（吃饭时间、睡眠-觉醒周期、血糖、活动等）相联系，那么一切都将充满不确定性。因此，对粪便样本分析是否能充分解决拟研究问题进行事先确定非常重要。第四，不同的生物信息学分析方法所对应的优点和局限性也各不相同。例如，基于16SrRNA的分类分析不能用于评估复杂菌群的功能。宏基因组鸟枪测序法虽然可以提供大量关于菌群功能的数据，但其成本很高昂，而且往往受到生物量的限制，以及人类DNA污染的影响，同时也需要大量劳动力进行分析。研究人员需要在项目设计阶段仔细推敲，哪些分析工具对解决研究问题而言是最合适的、最可行的，并且所提供的信息最有用的。第五，一般情况下，研究的常规做法是，将受试者按照常规组别（如炎症性肠病、体重、年龄组）进行分组，以此增加研究总体规模，从而获得更好的统计检验力。这种做法确实非常诱人，但如果模糊了某些相关性的话，或许会适得其反，因为这些相关性可能仅存在于更细分的样本子分类之间。这其实是一个重要的考虑因素，研究人群可以被细分得更同质化。例如，比起克罗恩病患者这一广泛性群体，回肠累及的克罗恩病患者就是一个更细分的子分类，因为克罗恩病患者虽然具有相似的临床特征，但却可能涉及多种不同的疾病表现和遗传因素。有一个例子与上述挑战相关，是对17例溃疡性结肠炎（UC）患者的前瞻性研究，这些患者都曾接受过全结肠切除术和复原性全结直肠切除并回肠储袋肛管吻合术（IPAA）。在这项研究开始前，所有受试者都处于“无病”期并且无药物治疗。17,18此项研究对受试者进行了为期两年的随访，并通过内镜方式对肠腔、储袋和“储袋前端”（靠近回肠储袋的区域）的菌群进行连续采样。随后，将这些内镜下采集的样本进行16SrRNA基因和宏基因组学测序分析，并对同一患者不同时期的粘膜基因图谱进行比较分析。所有数据都是基于患者元数据的背景下进行分析的，包括临床病程和表现，在此期间每个受试者都进行自身对照研究。正如预测的那样，19近一半的受试者发生了储袋炎，这提供了一个很大的效应值，同时也提高了建立宿主和微生物之间相关性的可能性。一种基于宏基因组分析和可视化的高分辨率平台，20揭示出特异性基因簇参与了荚膜多糖的生物合成过程，从而将储袋菌群和与其基因组成几乎相同的肠腔内菌群区分开来。荚膜多糖在微生物与环境的相互作用中具有多种生理功能。这一发现提出了一种可能性，即共生菌株或种群会朝着更适合于特定致病环境的方向转化，改变宿主-微生物的生态平衡，进而触发活动性疾病17。此外，在所有回肠储袋炎患者中都发现了一种异常的基因程序性反应。基因表达的变化与储袋炎的引发无关，也就是说，仅仅基因表达的变化并不足以引发储袋炎，但却很可能使这些患者处于危险之中18。我们发现，在UC患者的回肠袋粘膜中，出现了类结肠基因表达模式，这一发现是通过对Morgan等人21已发表的横断面研究数据资料进行重新分析发得来的，这些数据资料涉及的研究对象很庞大，包括UC储袋炎患者和患有家族性腺瘤性息肉病的储袋炎患者。不过这种变化在家族性腺瘤性息肉病患者中未曾发现。我们在UC患者中观察到的基因响应模式或许可以延伸到其他炎症性肠病（IBD）：Weiser等人22在克罗恩病患者的粘膜基因表达谱中观察到了几乎完全相同的变化。此类研究正在持续进行，以期校验核实这一发现。此外，还有一个重要的目的是希望确定疾病易感性的潜在因素，以及对引起UC储袋炎的可疑病原体进行识别、培养并开展功能性测试。无论何时，只要有可能，临床观察都应该遵循那些可以检验因果关系并明确潜在机制的实验方法。最后，这些数据必须回归临床环境，以确定实验结果是否具有相关性，以及在人体中是否能实现。这种临床观察和实验观察之间的迭代强化可以确保临床问题的正确解决。图1.横断面研究和纵向研究的研究设计取样和分析大多数研究都依赖粪便样本来评估肠道菌群，因为除了患者的自愿提供23和微生物DNA提取及测序所需的基本专业知识要求外，此类研究几乎不需要其他条件。然而，粪便主要是由结肠菌群组成，而非结肠粘膜菌群。它们最多只能代表结肠，除此之外，既不能代表肠道菌群的动态和局部变化，也不能作为通用的衡量标准16,24~26。最新小鼠研究表明，饮食和其他环境因素会影响宿主的代谢、免疫和消化功能，其中部分是通过影响小肠菌群来起到作用的。25,27,28当前，迫切需要新技术使小肠菌群研究成为可能，比如对小肠粘膜和内容物的低侵入性取样。虽然16SrRNA基因扩增子分析因其成本较低且相对快速而得到广泛应用，但也存在一些局限。对16SrRNA标记基因进行分析可以获取关于“那里有谁”的信息，但不能获得“它们在做什么”(即微生物功能）。此外，低分辨率限制了观察结果，其最多只能达到属的水平，而对于菌株种内的复杂多样性，即使在同一物种内，29,30也很难通过对比有关参照基因组来推断其功能。因此，16SrRNA标记基因分析法对机制研究而言仅能提供有限的分析价值。而目前仍旧需要进一步开发与体外人体类器官模型和体内无菌动物模型系统有关的替代方法，如代谢组学和代谢转录组分析，以评估微生物功能及其对宿主细胞的影响。然而，这些组学技术也有其缺点：成本高，劳动力需求大，需要生物信息学专业知识和有效生物质样品。由肠道干细胞培养获得的人体肠道类器官模型和动物模型，对于检验那些来自临床观察的假设以及对于机制和概念结论的形成而言，具有非常重要的价值。不过，这些发现与初始临床观察的相关性必须得到证实。据报道，人类和动物模型观察结果的差异性是由于物种特异性的差异而引起的，这些差异表现在宿主-微生物互作、环境、饮食和遗传响应。31因此，推荐采用并行调查或耦合调查相结合的方式来选取人体样本和实验模型，开展相关研究。图2宏基因组鸟枪测序法分析。生物信息学：建立整个系统新一代测序和元组学技术的快速发展，使人类肠道菌群研究过程中产生的大量数据得以集成和分析。虽然也有一些生物信息学平台开放了源码和参考数据库，但研究者在数据分析时也会面临一些挑战。首先，生物信息学分析在序列读取方面需要更健全的基因组和功能注释，并为数据分析、存储和集成提供更友好的用户通道。第二，为16SrRNA分析法而开发的各种平台和参考数据库32~38往往采用的是不同的过滤器和算法。因此，相同的数据通过不同的平台进行分析，可能会产生不同的结果39。第三，基于“鸟枪测序”所得的短读序列（50~个核苷酸）的宏基因组和宏转录组测序法目前生成的数据和其他大基因组数据，虽然提供了大量的信息，但仍旧需要机器学习和人工智能平台来“建立整个系统”。通过组装和聚类步骤来获得基因组分箱（将短读序列归类到功能子系统）并对这些分析方法进行注释，这或许具有一定挑战性，但是对实现种级分辨来说是不可或缺的。同时，正如16SrRNA分析法一样，也有几种不同的方法可以用来分析这些数据，20,40~42从而导致相同数据会有不同结论的情况。此外，很少有研究会认认真真对所推断的结论开展实验或临床验证（图2A）。组装和可视化平台（Anvio）20可以将短读邻接片段拼接成长的MAG（metagenome-assembledgenomes，MAGs），进行更准确的注释，并促进泛基因组分析。如果用鸟枪测序法对样本进行深度测序，或许可以获得MAGs，MAGs可以提供单一微生物种群的极高水平基因组分辨率17,43。在临床样本中确定特异性MAGs的能力将可以提供近乎完整的基因组草图，这对宏基因组序列分析的重要性不言而喻。但是，即使是有如此高的分辨率，MAGs仍需通过对MAG相关菌株进行传统培养及全基因组测序来进一步证实。这一结果会揭示出细微的基因组变异，哪怕是在近乎同基因型的微生物菌株之间也会出现。这种变异或许可以对表型和功能差异作出解释，并从基因组层面上提供机制分析。培养的菌株可以在体外肠类器官（提取自患者）和体内无菌动物模型中进一步表征其表型和功能（图2B）。无论如何，临床相关性和生理学意义始终都是研究的基础和前提。肠道菌群暗物质肠道菌群的细菌领域一直以来都受到了最广泛的

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