肠道里的菌群决定你是否得VKH

Vogt-Koyanagi-Harada（VKH）综合征是一种累及全身多系统的自身免疫性疾病，主要表现为全葡萄膜炎、脑膜刺激征、听力障碍、皮肤及毛发改变等,是我国葡萄膜炎中常见的一种类型。自身免疫、感染和遗传易感性被认为可能是本病的病因。既往研究发现Toll样受体(TLR)-3和TLR-4在活动性VKH患者中表达增加。而早期的实验数据表明，TLRs能够识别病原微生物中的配体，从而触发自身免疫反应。这些结果表明宿主微生物群落可能在VKH发病机制中起作用。

肠道菌群已被证明参与了许多免疫或炎症性疾病的发病机制中，如白塞病(BD)、类风湿关节炎(RA)、银屑病性关节炎(PA)、炎症性肠病(IBD)、多发性硬化(MS)、强直性脊柱炎(AS)和系统性红斑狼疮(SLE)。最近对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)模型的研究表明，在这个模型中，胃肠道中的微生物在驱动葡萄膜炎中起着关键作用。而VKH患者中肠道菌群的组成和功能是否改变目前未知，而这也是研究者的研究目的。研究者分析了VKH患者肠道菌群的种群和代谢通路，构建了有助于疾病诊断和预后判断的微生物相关基因标记物，并发现患者粪便微生物移植(FMT)可显著提高实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠（EAU）的病情严重程度。相关研究结果发表在GutMicrobes杂志上。

研究者首先收集了55份未治疗的活动性VKH患者和52份正常对照的粪便，提取DNA并进行宏基因组的测序，经过数据分析发现两组的肠道微生物组成有明显的差别。在种属水平上，相比正常组，未治疗的VKH患者的Ramularia，Alternaria，Rhizophagus菌属丰度增加，而Methanoculleus，CandidatusMethanomethylophilus，Azospirillum菌属则减少（图1a）。其中R.collo-cygni和A.alternata被确定为VKH富集的物种，Clostridiumspp.（Clostridiumsp.CAG:和Clostridiumsp.CAG:），Methanoculleussp.CAG:，CandidatusMethanomethylophilusalvus和Azospirillumsp.CAG:被确定为VKH减少的物种（图1b）。LEfSe分析进一步验证了活动性VKH患者和正常对照组之间的不同微生物特征，并有相似的结果。尤其是Paraprevotellaspp.（ParaprevotellaclaraCAG和Paraprevotella_clara）在活动性VKH患者中富集，而Clostridiumspp.（Clostridiumsp.CAG:和Clostridiumsp.CAG:），Bifidobacteriumspp.（Bifidobacteriumsp.MSTE12和Bifidobacteriumdentium），CandidatusMethanomethylophilusalvus和Methanoculleussp.CAG:则减少（图1c）。以上结果说明VKH患者存在肠道菌群的紊乱。

图1.VKH患者和正常对照的肠道微生物差别

接下来为了研究VKH患者的肠道菌群失调是否也存在于菌群的亚群中，研究者首先确定了在活动性VKH和正常对照组中丰度最高的20个种属。根据种属的相对丰度，通过层次聚类分析确定了VKH患者和正常对照组的三种肠型。通过LEfSe分析，确定了VKH患者和对照组之间三种肠型存在微生物组成的差异。Clostridiumspp.（Clostridiumsp.CAG:和Clostridiumsp.CAG:），Bifidobacteriumspp.（Bifidobacteriumsp.MSTE12和Bifidobacteriumdentium），CandidatusMethanomethylophilusalvus和Methanoculleussp.CAG:在1群的患者中丰度减少。在2群中，在VKH患者中，Paracteroidessp.CAG2丰度增加，Alistipesspp.(Alistipessp.AL.1和Alistipessp.CAG:29)，ProteobacteriabacteriumCAG:,Eubacteriumsp.CAG:和Roseburiasp.CAG:丰度减少。在3群中也发现Parabacteroidesspp.(Parabacteroidessp.2.1.7andParabacteroidessp.D25)和Bacteroidesspp.(BacteroidescoprocolaCAG:和BacteroidesthetaiotaomicronCAG:40)在VKH患者中丰度增加（图2）。

图2.VKH患者和正常对照3种亚群的分析

以上结果说明了肠道微生物组成在活动性的VKH患者和健康人间存在差别。为了进一步研究肠道微生物在VKH中的功能作用，研究者构建了来自两组的个非冗余基因集，并使用KEGG和eggNOG进行功能注释。LEfSe分析显示，活动期VKH患者与正常对照组之间有6个KEGG直系同源群（KO）和6个eggNOG直系同源群（OG）存在显著差异。在通路水平上，活动性VKH患者中有10条代谢通路明显上调，包括氧化磷酸化（ko）和脂多糖生物合成（ko）。此外，有54个模块包括脂多糖生物合成(M)、VI型分泌系统(M)、乙酰辅酶A还原通路(M)在VKH患者中更为丰富（图3）。

图3.VKH和正常对照组以及治疗前后患者的KO模块表达

另外研究者利用既往BD的相关数据与VKH进行比较发现，有9个物种与BD和VKH相关。但只有ParaprevotellaclaraCAG:在两种疾病中均增加。而3种Clostridiumspp.,Acidiphiliumsp.CAG:,Subdoligranulumsp.CAG:,CandidatusMethanomethylophilusalvus,Methanoculleussp.CAG:和Coprococcussp.CAG:在两种疾病中均减少。

研究者既往通过GWAS确定了VKH的3个易感基因位点，包括IL-23R-C1orf、ADO-ZNF-EGR2和HLA-DRA/HLA-DRB1。为研究这些易感基因位点是否与肠道微生物组成有关系，研究者根据3个基因位点上的6个SNPs（rs,rs,rs,rs,rs和rs）对54个活动性VKH患者进行基因分型。VKH患者被分为具有和不具有这些易感位点的两组。对这两组进行LEfSe分析发现HLA-DRA上的风险等位基因与两种VKH患者增加的物种Bacteroidessp.2.1.33B和Paraprevotellaclara呈正相关，与两种VKH患者减少的物种Alistipesfinegoldii和Eubacteriumeligens呈负相关。没有观察到肠道微生物组成与IL-23R-C1orf、HLA-DRB1或ADO-ZNF-EGR2之间的相关性。

免疫抑制剂可被用于治疗VKH，并已被证明能有效控制眼部炎症。研究11例活动性VKH患者在接受系统性糖皮质激素联合环孢素A治疗前后肠道微生物组成的改变。LEfSe分析发现与治疗前相比，治疗后微生物的9个属和27个种增加，15个种减少。在这些差异特征中，Acidaminococcussp.BV3L6在治疗后显著降低，而ProteobacteriabacteriumCAG、Azospirillumsp.CAG和Alistipessp.CAG显著升高。进一步分析治疗后微生物组功能改变，发现与治疗前相比，VKH患者治疗后36个模块增加，35个模块减少。在这些患者治疗前后出现显著差异的模块中，3个VKH减少模块增加，2个VKH增加模块减少（图3），提示肠道菌群与VKH具有相关性。

接下来为了检测肠道微生物是否与对治疗的反应相关。研究者总结了50个活动性VKH治疗后的临床资料，然后比较了30例非活动性眼部炎症患者和20例治疗后复发的眼部炎症患者的肠道菌群。LEfSe分析发现两组中有70个物种有差别。其中，5种Alistipessp.和Bacteroidessp.UW与治疗反应良好相关（图5a）。

为了建立VKH肠道的标记微生物，分析了55名VKH患者和52名正常对照的数据。最后选择一个由40个物种组成的分类标准。AUC曲线下面积为89.16%，95%CI为83.37%-94.95%（图4b）。该分类标准也在16例VKH患者和15例正常对照组中进行了验证。结果显示AUC值为83.75%(95%CI:69.74%-97.76%)，表明这些标记微生物可有效鉴别VKH与正常对照（图4c）。研究者提出了另一种基于37种炎症预后相关的标记微生物物种的分类标准（图5b），结果显示该分类标准能够区分预后良好的患者与复发的患者(AUC=93.65%，95%CI=86.87%-%)（图5c）。

图4.VKH患者和正常对照的分类标准

图5.用来预测预后的标记微生物

为了研究VKH患者的肠道微生物能否促进疾病的发展，研究者将患者粪便微生物移植（FMT）到实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠（EAU）中，观察小鼠的病程变化。经过抗生素处理的B10RIII小鼠分成3组，每组3只小鼠，分别接受VKH患者，正常对照粪便菌群和PBS对照。首先对抗生素处理的小鼠粪便样本和人类粪便进行16SrRNA基因测序分析。Shannon多样性指数（图6a）和PCoA分析（图6b）显示，经抗生素处理的小鼠粪便微生物多样性极低，且与人类粪便有明显的不同。EAU在接受VKH患者粪便菌群的小鼠中成功出现，临床表现有结膜充血、睫状充血、角膜水肿、虹膜后粘连、前房闪辉和细胞（临床评分:3.5~5）（图6c）。而在对照组（临床评分:0~1.5）和PBS组（临床评分:0~0.5）中只有1个出现了结膜充血的表现（图6e）。组织学分析显示在接受VKH组小鼠眼部有严重的葡萄膜炎症状，表现为视网膜结构破坏，如严重的视网膜皱褶和脱离，视网膜及脉络膜上有炎性细胞渗出，以及视网膜血管炎（组织学评分:2到4）（图6d）。而对照组（图6f）和PBS处理组（图6h）没有或很少观察到视网膜结构的异常（组织学得分:0到1）。因此临床和组织学结果均显示VKH组的评分均高于对照和PBS组（图6i-j）。

图6.VKH患者粪便菌群移植对EAU严重程度的影响

综上所述，活动性VKH患者以及不同肠型VKH患者的肠道微生物组成和功能发生了变化。这些改变在免疫抑制治疗后可以部分恢复。肠道菌群的差异与疾病易感基因型有关。微生物相关基因谱可用于区分VKH患者与对照组，也可用于预测治疗反应。此外，动物实验表明，肠道微生物组成可能是该病发展的一个重要因素。

参考文献：

Alteredgutmicrobiome

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